Die Mittelaltersammlung der Alten Galerie ist die zahlenmäßig größte und in ihrer Art bedeutendste in Österreich. Sie umfasst ca. 205 herausragende Tafelbilder, Schreinaltäre, Fresken, Fastentücher, Holz- und Steinskulpturen sowie 122 faszinierende Glasgemälde.

Die Bildwerke dieser Sammlung sind vorwiegend im Gebiet von Österreich, der Steiermark sowie in den Nachbarländern (heute Slowenien, Südtirol etc.) entstanden. Seit dem 19. Jahrhundert ist der Objektbestand kontinuierlich gewachsen, wobei vor allem die Vermächtnisse von Joseph August Stark, Ignaz Graf Attems und Baron Sessler-Herzinger neben den Geschenken von verschiedenen Pfarren und Dechanten erwähnenswert sind. Wertvolle Bestände aus den Stiften Admont und St. Lambrecht kamen während der Weltwirtschaftskrise der 1920er- und 1930er-Jahre hinzu.

Besondere Erwähnung verdient die Admonter Madonna, ein Hauptwerk der hochgotischen Skulptur von euopäischem Rang. Die Votivtafel bzw. die Kreuztragung aus St. Lambrecht repräsentieren ebenfalls auf europäischem Niveau die Ausstrahlung der „Internationalen Gotik“ in der Steiermark. Unter den Hauptwerken der Spätgotik sind Tafeln von Michael Pacher sowie dem Umkreis von Friedrich Pacher und Marx Reichlich zu nennen. Den wachsenden Einfluss der Renaissance auf die Entwicklung der heimischen Kunst belegen der monumentale Große Mariazeller Wunderaltar sowie die Tafel des Heiligen Martin aus Bruck an der Mur, nach der der unbekannte Meister benannt ist.

Hinzu kommt ein ansehnlicher Bestand an hoch- und spätgotischer Glasmalerei aus heimischen Kirchen (Pichl bei Tragöß, Straßengel, Gratwein). Regional bedeutsame Zeugnisse gotischer Wandmalerei runden das Bild eines komplexen mittelalterlichen Kulturerbes ab.